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Lozada , Camille , 1996-....

Lubin-Germain , Nadège , 19..-....

Ballet , Steven

Faure , Sophie , 19..-.... , chimiste

Martins , José C.

CY Cergy Paris Université , 2020-....

Vrije universiteit Brussel , 1970-....

École doctorale Sciences et ingénierie , Cergy-Pontoise, Val d'Oise

Biomolécules : conception, isolement, synthèse , Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine , 2002-....

Modification des propriétés membranotropiques de peptides de pénétration cellulaire et de fusion au moyen de dérivés de tryptophane conformationellement contraints , Camille Lozada ; sous la direction de Nadège Lubin-Germain et de Steven Ballet

Thèse soutenue en co-tutelle

Titre provenant de l'écran-titre

Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Sciences et ingénierie

Partenaire(s) de recherche : Biomolécules : conception, isolement, synthèse (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2002-....) (Laboratoire)

Autre(s) contribution(s) : Steven Ballet, Sophie Faure, José C. Martins (Membre(s) du jury) ; Sophie Faure, José C. Martins (Rapporteur(s))

Thèse de doctorat Chimie - Cergy CY Cergy Paris Université 2023

Thèse de doctorat Chimie - Cergy Vrije universiteit Brussel (1970-....) 2023

Les peptides membranotropes sont généralement de courtes séquences capables d'interagir avec des membranes. Parmi ces peptides bioactifs, deux catégories de peptides ont été étudiés, les peptides de pénétration cellulaire (CPPs) et les peptides de fusion (FPs). Les CPPs sont généralement cationiques et ont déjà été largement étudiés pour leur capacité à traverser les membranes et par conséquent pour leur utilisation afin d'améliorer l'internalisation d'agents thérapeutiques. Les FPs sont de courtes séquences hydrophobes localisés sur les protéines virales des virus enveloppés. Ils sont essentiels pour le processus d'infection car ils s'insèrent dans la membrane de la cellule hôte pour permettre à la membrane virale de fusionner. Notre équipe a développé une méthode de vectorisation en utilisant les FPs du virus de l'hépatite C (HCV) comme point d'ancrage dans les membranes biologiques. Cependant, les études préliminaires ont démontré une activité membranotropique modérée, qui pourrait être reliée manque de structuration des peptides, une caractéristique cruciale pour l'activité membranotropique. C'est pourquoi, il a été décidé d'introduire des acides aminés contraints afin d'induire ou de faciliter la structuration de ces peptides. De plus, les peptides membranotropes sont souvent constitués d'acides aminés aromatiques, et plus particulièrement le tryptophane (Trp). Ainsi, deux dérivés cycliques du Trp ont été choisis comme contraintes locales : un dérivé tetrahydro-b-carboline Tcc et un indoloazepinone Aia. Ils ont été synthétisés pour pouvoir être introduits par SPPS dans les peptides membranotropes. Ces dérivés possèdent des angles dihédraux contraints, limitant la rotation et l'orientation des chaînes latérales, pouvant influencer la structure et l'activité membranotropique des peptides. Pour étudier l'influence de ces contraintes locales sur l'activité membranotropique et la structuration, nous avons sélectionné quatre peptides de référence : un CPP (RW9) et trois peptides viraux (HCV7, Flav et C8). Ces peptides ont été synthétisés par SPPS et les résidus Trp ont été remplacés soit par Tcc soit par Aia, permettant de varier le nombre de modifications et leurs positions. Ainsi, une librairie de 34 peptides a été obtenue. Leur activité membranotropique a été évaluée par suivie par titration en spectrofluorescence, en présence de liposomes (DMPG ou DMPC), permettant de calculer des coefficients de partage ((Kp). Les résultats ont démontré que l'amélioration de l'activité par l'incorporation de Tcc ou Aia était séquence dépendante et influencée par le nombre et la position des modifications. Les peptides [Aia4]RW9 (H-RRW-Aia-Arg-RWRR-NH2) et [Tcc1,4]C8 (Ac-Tcc-ED-Tcc-VGWI-NH2) ont été identifiés comme ayant les meilleures activités, avec des valeurs de Kp trois fois supérieures à celles obtenues pour les peptides natifs. Des études supplémentaires par dynamique moléculaire (MD) ont pu être corrélées avec les tendances observées expérimentalement. Des études structurales des peptides par dichroïsme circulaire (CD) en solution tampon ou en présence de micelles ont été effectuées. Enfin, des études en milieu de culture cellulaire des peptides couplés à une sonde fluorescente (FITC) avec des cellules CHO-K1 ont été effectuées pour des études de perméabilité par microscopie confocale.

Membranotropic peptides are generally short sequences that can interact with membranes. Among these bioactive peptides, two categories of peptides were studied during this thesis: cell-penetrating peptides (CPPs) and viral fusion peptides (FPs). CPPs are usually cationic and have already been well studied for their capacity to cross cellular membrane and therefore to improve therapeutic agent cellular uptake. On the contrary, FPs are short hydrophobic sequences found in viral proteins. They are essential for enveloped viruses because of their capacity to insert into the host cellular membrane to subsequently allow the viral membrane to merge during the infection process. Our group developed a vectorization method using FPs of hepatitis C virus (HCV) as anchors into biological membranes. However, preliminary results showed a moderate membranotropic activity, probably due to their lack of structuration, a crucial feature for membranotropic behavior. Therefore, it was suggested to introduce constrained amino acids to induce or facilitate peptide structuration. Interestingly, membranotropic peptides often bear aromatic amino acids and particularly tryptophan (Trp) residues. Thus, two cyclic Trp surrogates were chosen as local constraints and synthesized as suitable building block for SPPS to be incorporated in membranotropic peptides: a tetrahydro-b-carboline derivative Tcc, and an indoloazepinone scaffold Aia. These surrogates present constrained dihedral angles and limited side chain orientation which may influence the peptide's structure and/or membranotropic activity. To study the influence of the introduction of these local constraints on membrane activity and structuration, we selected four reference peptides: one CPP (RW9) and three viral peptides (HCV7, Flav, and C8). These peptides were synthesized by SPPS and Trp residues were replaced by either Tcc or Aia building blocks, varying the number of modifications and their positions, resulting in a series of 34 peptides. Their membranotropic activities were studied by spectrofluorescence titration in presence of liposomes (DMPG or DMPC), allowing to calculate partition coefficient (Kp). Results showed that improvement of the activity by introducing Tcc or Aia was sequence dependent and influenced by the number of modifications. The most potent peptides were found to be [Aia4]RW9 (H-RRW-Aia-Arg-RWRR-NH2) and [Tcc1,4]C8 (Ac-Tcc-ED-Tcc-VGWI-NH2) which showed Kp values 3-fold higher than their native counterparts. Further studies by molecular dynamics (MD) simulations were in correlation with the trend experimentally observed. Structural studies were performed by circular dichroism (CD) in buffer and membrane mimetic environment. Finally, tagged version of the peptides with fluorescein were added to culture medium of CHO-K1 cells for permeation studies using confocal microscopy.

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